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产品概述
product description
贝博® BBproExtra® 细菌外膜蛋白提取试剂盒（双向电泳用）可以从各种革兰氏阴性菌菌体中提取外膜蛋白。
本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细菌外膜组份。提取过程简单方便。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白不含盐，可直接用于2D电泳。
如下游实验不需要直接用于等电聚焦、双向电泳等，可选用用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验的试剂盒（相关产品BB-31512）。
贝博® BBproExtra® 可以提供各种蛋白质提取、裂解、酶活测定、细胞器分离、免疫组织化学、蛋白表达、蛋白标记等蛋白质相关试剂盒产品。
贝博® BBproExtra® 可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、藻类、液体、土壤等各种不同样本的蛋白提取试剂盒。
贝博® BBproExtra® 可以提供针对细胞膜、核、胞质、线粒体、溶酶体、高尔基体、内质网、外泌体等细胞不同部位的蛋白提取试剂盒。
保存温度
2-8℃
注意事项
1. 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
2. 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
双向电泳（2D）
适用样本
细菌
产品特点
1. 使用方便。
2. 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3. 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4. 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
5. 本品不含EDTA，可以用于金属螯合层析等下游应用。
2. 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
3. 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
4. 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
5. 本品不含EDTA，可以用于金属螯合层析等下游应用。
仪器准备
1. 离心机
2. 振荡器
3. 涡旋混匀器
4. 移液器
5. 冰箱
6. 冰盒
2. 振荡器
3. 涡旋混匀器
4. 移液器
5. 冰箱
6. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液
2. 蛋白定量试剂盒
2. 蛋白定量试剂盒
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
2. 吸头
3. 一次性手套
使用注意事项
1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4. 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
使用方法
1. 提取液准备：
每500 μl提取液A中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
2. 收集待提取菌体，用PBS洗菌体2次。
3. 按每50-150 mg湿重菌体样本加入500 μl提取液A（大约菌体和提取液体积比1:2-1:5，完全淹没菌体即可），吹打混匀，在2-8℃振荡30分钟-1小时。
4. 将提取液在2-8℃下，12000×g力离心5分钟，取上清。
5. 将上清液在37℃水浴10分钟。
6. 在37℃ 500-1000×g力离心5分钟。
7. 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约30-50μl液体。
8. 用50-150μl冷的膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得细菌外膜蛋白样品。
9. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
每500 μl提取液A中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
2. 收集待提取菌体，用PBS洗菌体2次。
3. 按每50-150 mg湿重菌体样本加入500 μl提取液A（大约菌体和提取液体积比1:2-1:5，完全淹没菌体即可），吹打混匀，在2-8℃振荡30分钟-1小时。
4. 将提取液在2-8℃下，12000×g力离心5分钟，取上清。
5. 将上清液在37℃水浴10分钟。
6. 在37℃ 500-1000×g力离心5分钟。
7. 此时液体分为2层，小心移除上层溶液，留管底部下层大约30-50μl液体。
8. 用50-150μl冷的膜蛋白溶解液溶解该溶液，即得细菌外膜蛋白样品。
9. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
常见问题分析
1. 蛋白浓度低？
膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4. 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
蛋白样品中含有去垢剂，注意蛋白定量方法的选择，防止不合适的方法导致的蛋白浓度数据异常偏高，从而导致依据错误的蛋白浓度数据上样导致上样量不够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最后采用低电压低电流电泳。
膜蛋白丰度较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
2. 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
3. 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
4. 膜蛋白电泳没有条带？
膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
蛋白样品中含有去垢剂，注意蛋白定量方法的选择，防止不合适的方法导致的蛋白浓度数据异常偏高，从而导致依据错误的蛋白浓度数据上样导致上样量不够。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%-10%。
有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
电泳时最后采用低电压低电流电泳。
参考文献
1. Yanshan Gong, et al.
Characterization of the hemolytic activity of Riemerella anatipestifer
Microbiology-SGM 2020
2. Lili Chen, et al.
Ultrasensitive detection of H. pylori in human beings feces based on Immunomagnetic Beads capture and fluorescent quantum dots
Analyst 2019
3. Tongxiang Song, et al.
Characteristics of the iron uptake-related process of a pathogenic Vibrio splendidus strain associated with massive mortalities of the sea cucumber Apostichopus japonicus
Journal of Invertebrate Pathology 2018
Characterization of the hemolytic activity of Riemerella anatipestifer
Microbiology-SGM 2020
2. Lili Chen, et al.
Ultrasensitive detection of H. pylori in human beings feces based on Immunomagnetic Beads capture and fluorescent quantum dots
Analyst 2019
3. Tongxiang Song, et al.
Characteristics of the iron uptake-related process of a pathogenic Vibrio splendidus strain associated with massive mortalities of the sea cucumber Apostichopus japonicus
Journal of Invertebrate Pathology 2018
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